Fülöp Eszter

Szakmai gyakorlatnak mindenképp egy olyan kutatóintézetet szerettem volna választani, ahol olyan új ismereteket szerezhetek amikre egyébként nem lenne lehetőségem. Ezért is választottam a KOKI-t (Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet), ugyanis amellett, hogy az ország egyik legnagyobb kutatóintézete, ettől független a diákok oktatására is kellőképpen oda figyel, ha nyári gyakorlatról van szó.

Az előző mobilitásból szerzett tapasztalatoknak hála minden rendben ment a lakás kereséssel. Egyedüli probléma talán ami felmerült, az az volt, hogy nehéz olyat találni, ami rövidtávra kiadó, legtöbb esetben minimum 1 év a bérlési idő. Ezért érdemes hogyha már hetekkel azelőtt megvan a lakás.

A mobilitás előtt volt egy online meetingem az intézettel, ahol felvázolták az ott zajló kísérletek lényegét. Ennél a pontnál vált világossá az is, hogy az intézetben zajló kísérletek számottevő része állatokon zajlik. Számomra egy teljesen ismeretlen terület volt, mivel eddig csak mikroorganizmusokkal dolgozhattam. Nagyon izgatott voltam emiatt, hiszen egy teljesen új dologba csöppenhettem bele.

Az első nap az intézet körbevezetésével telt. Bemutatásra kerültek azok a laborok és helységek, ahol a Lendület Rendszer-Neurobiológia Kutatócsoport (az intézeten belül 36-os csoport) tagjai kísérleteznek. Elmagyarázásra került nagy vonalakban a csoport által végzett kísérletek lényege és azok a dolgok, amiket én is elsajátíthattam az ott töltött idő alatt. A kísérletek jelentős része a VVE (Viselkedés Vizsgáló Egység)-ben zajlott, ahová az előírásoknak megfelelő öltözetben lehet belépni, kizárólag engedéllyel. A VVE-be való belépést követően maszkot, kesztyűt köpenyt és bent található papucsot kell viselni. A kísérletek többsége, amelyekhez csatlakoztam, és a perfundálás a VVE laborjaiban zajlott. Egy másik helyiség, az intézet területén található külön műhelyek, más néven workshopok. Ezek biztosítanak helyet és eszközöket a kísérletezéshez szükségek kellékek elkészítéséhez. A fiberek megépítésé - egyebek között - itt zajlik. Az ott létem alatt ez a két helyiség volt meghatározó, de ettől független más laborokba is bejárásom volt, mivel a legtöbb gép, eszköz és berendezés csak az adott laborban foglal helyet.

A kísérlet során használt egerek génmódósítottak, tehát olyan adenovírussal fertőzöttek, amely transzgén Chat-Cre-t tartalmaz és műtét során kerül be az állat agyába. A Channelrhodopsin2 ami a neuronok depolarizálására szolgál abban az esteben, ha fénnyel történik a stimuláció. Ahhoz hogy az opszin tartalmú neuronok megvilágításra kerüljenek az agyi régió felé száloptikás implantátumot kell elhelyezi.

Az implantátumhoz szükséges fiberek a workshopban kerülnek megépítése és elengedhetetlen lépés a kísérlethez. A fiberek olyan szálak, amelyek 200-400 µm-es optikai szálat tartalmaznak, optogenetikai és szálfotometriai kísérletek folyamán alkalmazzák. Két féle fíbert kell építeni. Az egyik esetében csak a kerámia réteg veszi körül az üvegszálat. Itt kritikus az, hogy egy egyenes töréssel kerüljön elvágásra az üvegszál, hogy maximális hatékonysággal vezesse a fényt. Az üvegszál fel van tekerve és ebből kell kimérni a megfelelő hosszúságú szálat. A szálat egy stripperelő segítségével kell megszabadítani a műanyag borítástól. Egy rubinfejes vágó segítségével pedig pontos vágást kell ejteni a kimért hosszúságú szálon. A hosszúság függ attól, hogy az implantátum milyen agy területet céloz meg. Mikroszkóp segítségével kell meghatározni, hogy megfelelőnek bizonyul a törés vagy sem. Tükörsima felületet kell kapni mindkét oldalon annak érdekében, hogy a fénytörés a lehető legkisebb legyen. Ezután pillanatragasztóval rögzítjük a kerámiában a szálat és 24 órát száradni hagyjuk.

A csiszolandó fíberek esetében az üvegszál vékonyabb és a kerámiát egy fém réteg veszi körül. A lemért méret után szintén elvágjuk az üvegszálat. Hasonlóképpen itt is stripperelés, vágás és ragasztás. A 24 óra letelte után a kerámia felöli részét kell majd csiszolni egy csiszoló korong és csiszoló papír segítségével, valamint mikroszkóp alatt kell ellenőrizni a fiber aktuális állapotát. Ennél is fontos az, hogy tükörsima felületet kapjunk. Különböző erősségű csiszoló papirokon kell fordítót nyolcas alakban csiszolni, folyamatosan azt vizsgálva, hogy egyre tisztább a felület. Az elkészült fíberek használat előtt lemérésre kerülnek. A lemért fiberek legalább 75%-os értéket kell elérjenek ahhoz, hogy használhatóvá váljanak.

A kész fiberek implantátumként kerülnek be az egerek fejébe és ehhez előszőr le kell mérni őket. Ezután ketamin-xilazin injekciót kapnak, ami altató és izomlazító hatást fejt ki intraperitoneálisan, közben fontos a reflexek és légzés figyelése. A fejet a műtéthez le kell borotválni és le kell fertőtleníteni betadinnal. Az állat szemét be kell kenni szemvédő krémmel, hogy az erős fény hatására megakadályozzuk a kiszáradást. A fej ezt követően rögzítésre kerül. A koponyáról el kell távolitani a bőrt, kötőszövetet és csonthártyát is. A megtisztított koponyára karcolásokat kell ejteni, hogy növelve legyen a felülete az implantátum felhelyezéséhez. Fogászati cement segítségével kell megépíteni az implantátumot úgy, hogy az üvegszál a megfelelő agyterületre kerüljön be, mivel a későbbiekben a kísérlet során stimulálva lesz. A mi esetünkben az implantátum a lateral septumba került, mivel itt a kolinerg sejteket vizsgáltuk. A beműtött egerek egy hétig gyógyulnának. A gyógyulást követően indításra kerül a kísérlet.

Az ott létem alatt több kísérletben is részt vettem. Az egyik ilyen kísérlet során egy kerek alakú arénában vizsgáltuk azt, hogy az egér az aréna középzónájában vagy a falak melletti perifériában tölt több időt. A kísérlet lényege, hogy a szorongásszerű viselkedést vizsgáljuk. Az aréna perifériájában, valamint a mediánján eltöltött idő aránya adja azt az értéket, amiből megállapítható az, hogy az állat mennyire szorong és milyen szinten explorál a kísérlet során. Első lépésben össze kell szerelni a rendszert, mivel a kísérleti hely nem állandó és a csoportok különböző kísérleteket végeznek. A rendszer áll egy laptopból, lézerből, kamerából és különböző kábelekből, amivel össze lehet kötni a lézert a számítógéppel. A kísérletek 1-3 Lux körüli vörös fényben zajlanak, mivel az egerek számára a fehér fény averzív. Egy külön helyiségben található számítógéppel össze van kötve a rendszer és ezen keresztül figyeljük az egerek tevekénységet. Az aznap kísérletezendő egerek implantátuma a bőrük alatt helyezkedett el. A kísérlet során felhasználtunk kontroll továbbá channelrhodopsin csoportot. A kísérlet több napon át zajlik, mivel a stimulálási kondíció is változik. Első nap nem kap stimulálást, mivel van amikor a henger belseje és van amikor csak a perifériája van stimulálva. Az ebből kapott eredmények kerülnek kiértékelésre a kísérlet lejárta után.

Egy másik hasonló kísérlet az „emelt keresztpalló” teszt, ahol az egér szabadon döntheti el, azt hogy a nyílt vagy a zárt karban szeretne több időt tölteni. Az egerek alapjáraton a szűk, zárt teret preferálják, ez a tulajdonság a thigmotaxis, de igényük van arra, hogy exploráljanak. A két folyamat ellenkező, mivel ahhoz hogy exploráljon ki kell mennie a nyílt térre. A nyílt és zárt tér arányából kiszámolható az, hogy az egér mennyire explorál. A sejteket stimulálva pedig megfigyelhető az, hogy ezek aránya merre fele tolódik el. A kísérlet során fontos, hogy összehasonlításra kerüljön a kontrol és a channelrhodopsin-t, azaz a fényérzékeny csatornát expresszáló neuronokat tartalmazó csoport. Az összeszerelés hasonló módon játszódik le, mint a többi kísérlet esetében. A különbség viszont az, hogy az egerek fejében üvegszálas implantátum van, ezen keresztül jut be a fény az egér agyába. A stimuláció mechanizmusa ugyanaz, ez esetben is.

Ezek mellett még egy olyan kísérletet is láthattam, ahol hím egér vizeletét alkalmazva megvizsgáltuk azt, hogy miként reagálnak rá a nőstény egerek. Az éles kísérletben részt vevő egereknek szűrőpapírra pipettázott vizeletet helyeztünk el egy felfüggesztett kupakba, míg a kontrol egerek fiziológiás sóoldatot kaptak. Megfigyelhető, hogy azok az egerek amelyek nem találkoztak sohasem hímmel, ösztönösen felfigyelnek a szagra és érdeklődést mutatnak. Az hogy ez miként zajlik le sejt szinten azt a kísérlet eredményeiből lehet megállapítani.

A több napon át tartó kísérlet után az egereket le kell perfundálni. Első lépésben fontos lemérni az állat súlyát, mivel ennek függvényében kap ketamin-xylazin oldatot. Fontos, hogy ne kapjon túl nagy dózist, mert idő előtti halált okozhat. Ezután fel kell nyitni a hasfalat és a rekeszizmot, hogy a szívhez juthassunk. Egy tompa végű tű segítségével fiziológiás sóoldatot juttattunk az érrendszerbe a szíven keresztül. Ez lehetővé teszi, hogy a vér kimosódjon az agyból. Ezután PFA-t kell hasonló módon bejuttatni, ami reakcióba lép a fehérjékkel és ezzel fixálja a szövetben levő fehérjét. Ezt követően az állatot le kell fejezni és el kell távolitani az agyát, figyelve arra, hogy ne kerüljön bele csontszilánk, ami megsértheti az agyat. Az agyak ezután metszésre kerülnek.

A metszés tulajdonképpen egy előkészítő lépés az immunhisztokémiához. A blokkok (metszendő agyak), PFA oldatban vannak. A blokkok kisagyi részét eltávolítjuk azért, hogy csak a vizsgálni kívánt agyterület kerüljön metszésre. A metszeni kívánt részt körlemezre ragasztjuk és elhelyezzük a vibrotome kád részébe. Felöntjük foszfor pufferrel és elindítható a metszés. A metszés lényege hogy vékony agyszeleteket vágjunk a rögzített blokkból. Az elszedéshez egy vékony, finom végű festőecsetet használunk és a metszetek alá nyúlva, óvatosan a microarray kiskádba helyezzük, úgy hogy egy adott magasságból több metszet kerüljön egy kiskútba. A szövet átvágásához a vibrotome rezgő pengét használ, ezért fontos figyelni arra, hogy a metszetek elszedése során az ecset ne kerüljön a penge elé, mert az megsérülhet. A metszés menete kétféle képpen zajlik. Lehet automatikus vagy manuális üzemmódban. A kettő közti lényeges különbség, hogy az automatikus folyamatosan, megállás nélkül végzi a metszést, míg a manuális esetében metszetenként megáll és gombnyomásra indul.

A metszeteket ezt követően meg kell vizsgálni, a Paxinos atlas szerint, hogy melyik az az agy terület, amivel a későbbiekben dolgozni fogunk, majd ezeket külön kell szedni. A mosás lényege, hogy egy kedvezőbb közeget hozzunk létre az immunhisztokémiához. Ezt a lépést 3x10 vagy a nagyobb hatékonyság érdekében 4x8 alkalommal kell végezni. Humán szérum albumint tartalmazó oldatot kell készíteni a megadott paraméterek alapján. A metszeteket tartalmazó üvegcsékbe öntjük az oldatot és egy óra várakozási idő szükséges ahhoz, hogy kiküszöböljük a fehérjék nemszelektív kötődést a későbbi immunhisztokémia folyamán.

Az immunhisztokémia (IHC) egy hatékony technika, amely az antitest és az antigén közötti specifikus kötődésen alapszik. A sejtekben és szövetekben található specifikus antigének kimutatására és lokalizálására szolgál. Leggyakrabban fénymikroszkóppal detektálhatók a sejtek.

A kísérletek célja az, hogy sejttípus specifikus neuronpopuláció stimulálódjon és a vizsgálata után megismerésre kerüljön az, hogy ennek hatására hogyan változik a viselkedés .

Az intézetben töltött idő alatt részletes képet sikerült kapnom arról, hogy az intézet által végzett kísérlet milyen célt is szolgál. Hétről hétre egyre több folyamatot végezhettem önállóan. És az utolsó hetekben a kísérletek egy részét és a fiberek csiszolását valamint mérését már önállóan, minimális felügyelet mellett is végezhettem. A perfundálásban is aktívan részt vettem és az agy koponyától való tisztítását és a blokk metszését is saját kezűleg végezhettem. A személyes tapasztalatom nagyon pozitív, mivel az intézet rengeteg dolgot megtanított és rengeteg ismeretet szerezhettem az idegtudomány területről.