Geréd Boglárka

Kötelező szakmai gyakorlatomat az előző évhez hasonlóan az ERASMUS+ keretein belül végeztem, idén a Debreceni Egyetem Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézeténél, a Proteomika Szolgáltató Laboratóriumba gyakorlatoztam.

A laboratórium proteomikai és metabolomikai vizsgálatokat végez egyetemi, klinikai és ipari megrendelők számára, ugyanakkor kiemelt hangsúlyt fektetnek a kutatás mellett az oktatásra. Több PhD hallgató itt végzi kutatásait és évközben TDK munkát végző hallgatókat is fogadnak. Fő profiljuk a különböző mintákból (szövet, könny, nyál, verejték, vér) származó fehérjék azonosítása, különféle metabolitok és kis molekulák LC-MS analízise.

A proteomika egy olyan kutatási terület, amely rendszerszinten vizsgálja egy adott sejt, szövet vagy szervezet teljes fehérjekészletét. A vizsgálatok során elengedhetetlen a gondos tervezés, a pontos mintaelőkészítés, ezt követi a műszeres analízis (LC-MS) és a mért adatok kiértékelése. A mérést megelőzően fontos, hogy a minta minél kevesebb lépésen menjen keresztül, ezzel is elkerülve a veszteséget, mivel az esetek többségében nem áll rendelkezésre akkora mintamennyiség, hogy ismételni lehessen a folyamatot.

A gyakorlat során két proteomikai mintaelőkészítési módszerrel: az oldatban illetve a gélben emésztéssel ismerkedtem meg, ezen folyamatok során a fehérjéket először kisebb peptidekre hasítjuk majd ezeket a peptideket elemezzük tömegspektrometriával. A kapott peptid-szekvenciákból, a tömegspektrumok alapján, a fehérje adatbázisok segítségével azonosíthatjuk a mintában levő fehérjéket.

A fehérje emésztési folyamat során kimondottan fontos a keratinmentes környezet biztosítása , fülke alatt dolgozunk, púdermentes kesztyűben, köpenyben, karvédővel.

Az oldatban emésztés során első lépésként a fehérjéket urea oldattal denaturáljuk, ezt követően DTT (dithitreitol) oldat hozzáadásával a diszulfid hidakat redukáljuk. Inkubálás után IAA (jódacetamid) oldattal alkilezzük a szabad tiol csoportokat, ezáltal megakadályozva a diszulfid-hidak újboli kialakulását, így a fehérje teljesen denaturált állapotba marad az emésztéshez. A mintát ammónium-bikarbonát oldattal kihígítjuk, hogy az urea ne gátolja az enzim működését, valamint pufferként biztosítsa az optimális pH-t. Az emésztéshez tripszint használunk, majd inkubálás után az enzim működését tömény hangyasavval leállítjuk. A keletkezett emésztményt C18-tartalmú pipettahegyek (PierceTip – ThermoScientific) segítségével sómentesítjük, a kész peptideket Speed-Vac segítségével beszárítjuk és mérésig fagyasztva tároljuk.

A gélben emésztés során először a gélkép alapján meghatározzuk és kivágjuk a megfelelő fehérje sávokat, majd ezeket kb. 1mm³-es kockákra daraboljuk. A festékmentesítés ammónium bikarbonát/acetonitril oldattal történik többszöri ismétléssel, a mosás során a gél dehidratálódik, zsugorodik, a teljes dehidratálás pedig Speed-Vacben történik. Ezt követik a redukálási, alkilálási, emésztési lépések, hasonlóan az oldatban emésztéshez. A kapott peptideket acetonitriles oldattal exhtraháljuk a géldarabokból, majd beszárítjuk és mérésig fagyasztva tároljuk.

A két hónap alatt több alkalommal csatlakoztam LC-MS mérésekhez, a készülék tisztításához és megfelelő működésének fenntartásához szükséges oldatcserében is aktívan részt vettem heti gyakorisággal, melynek lépései az oldatok elkészítése, szűrése, szonikálása és cseréje.

A proteomikai vizsgálatok mellett részt vettem metabolomikai vizsgálatokban is: többféle metabolit LC-MS vizsgálatában és a hozzá kapcsolódó mintaelőkészítésben (extrakció, derivatizáció). A tömegspektrometriás mérési eredményeket követően a mért adatokból információt kapunk arról, hogy milyen fehérjék, és ezek milyen mennyiségben vannak jelen a vizsgált mintában. Viszont szükséges tovább keresni, hogy mi adhat ’’értelmes’’ magyarázatot a fehérjék funkcióira. A köztük lévő kapcsolatok tanulmányozása, hálózati ábrázolásának elemzése segítségünkre lehet ebben. A gyakorlatom második felében a STRING adatbázist tanulmányoztam. A STRING, mint vizualizációs eszköz is megkönnyíti biológiai kontextusba helyezni a fehérjeazonosítási adatokat. Ez egy nyilvánosan elérhető adatbázis, mely a fehérje-fehérje interakciókat ábrázolja, így a fehérjék nem különálló egységekként, hanem egy hálózat részeként vizsgálhatók.

A doktorandusz hallgatók munkájába is betekintést nyerhettem, így több alkalommal kísérhettem végig Western-blot analízist, valamint Olink méréseket is. Az ún. Proximity Extension Assay (Olink) technológia lehetővé teszi nagyszámú fehérje kimutatását nagyon kis mennyiségű mintából. Az adott fehérjékre specifikus antitestekhez nukleotid szekvenciák vannak kapcsolva, amennyiben két antitest ugyanahhoz a fehérjéhez kapcsolódik, az antitestekhez kapcsolt  nukleotid szekvenciák közel kerülnek egymáshoz, amely ezt követően lehetővé teszi a kialakuló DNS szál PCR-el történő amplifikálást. A qPCR reakció során detektált jel intenzitása egyenesen arányos a fehérje mennyiségével, így kvantitatív adat nyerhető a vizsgált mintában előforduló fehérjékről.

A munka mellett természetesen jutott idő a kikapcsolódásra is, részt vettem a Bor- és Jazz napokon, a Beer by Lake rendezvényen, felkerestem a kedvenc helyeimet, valamint hosszú sétákat tettem a városba, amelyek végén valahogy mindig a Nagyerdőn kötöttem ki. A természet közelsége mindig feltöltött, és segített kiszakadni a nagyvárosi mindennapok rohanásaiból.  Az Államalapítás Ünnepét a város 5 napig tartó kulturális programsorozattal tette különlegessé, melynek fénypontja a Virágkarnevál volt. A virágokkal díszített kompozíciók nemcsak látványosak voltak, hanem üzenetet is hordoztak, a város hagyományait és közösségi erejét is tükrözték. A felvonulást kísérő tánccsoportok, zenekarok és nemzetközi fellépők színesítették a programot, így a Nagyerdei Stadiontól a belvároson át mindenütt ünnepi hangulat uralkodott.

Összességében a gyakorlat értékes tapasztalat volt számomra. Fontos kiemelnem, hogy a csapat, akivel dolgoztam, rendkívül baratságos és befogadó volt, nemcsak szakmailag, hanem személyesen is nagyon sokat hozzátettek, ahhoz, hogy egy felejthetetlen nyaram legyen. Hálás vagyok minden pillanatért. A proteomika területén nemcsak elméleti tudást szereztem, hanem közvetlenül is megismerhettem hogyan zajlanak a fehérjeanalitikai vizsgálatok a gyakorlatban. A két hónap alatt rájöttem, hogy ez a kutatási terület rendkívül összetett, több tudományterület ismeretének ötvözése szükséges ahhoz, hogy a pontos laboratóriumi munka, a műszeres mérések és a mért adatok kiértékelése sikeresen megvalósuljon. Ez a terület egyszerre igényel kémiai, biológiai, statisztikai és némi informatikai tudást, és talán a legfontosabbat: logikus, rendszerszintű gondolkodást.

Zárásként mindenkit bátorítok arra, hogy éljen a lehetőségekkel, ne hátráljon meg a kisebb-nagyobb buktatóktól, mert a kihívások gyakran a legnagyobb fejlődési lehetőségeket rejtik magukban!