Kristály Noémi

A 2023/2024-es tanévben lehetőségem nyílt, hogy szaktársaimmal, Domokos Emesével és Gál Mátyással együtt, Budapesten, a Semmelweis Egyetem Molekuláris Biológia Tanszékén végezzem a nyári szakmai gyakorlatot, az Erasmus + keretén belül. Itt Dr. Kereszturi Éva kutatásába tudtam bekapcsolódni.

A gyakorlat során az NCB5OR missense mutációit vizsgáltuk. Az NCB5OR fehérjéről jelenleg keveset tudni. Szerkezete alapján valószínűsíthető, hogy egy természetes fúziós fehérje, melyben egy citokróm B5 és egy citokróm B5-reduktáz domén kapcsolódik össze rövid linker régión keresztül. A fehérje a citoszolban lokalizálódik, pontos funkciója jelenleg még nem ismert, de az valószínűsíthető, hogy fontos szerepet játszik a lipidanyagcserében. Ezen kívül az NCB5OR knock out egereknél megfigyelték, hogy II típusú diabétesz alakult ki.

A kutatás során kiválasztásra kerültek azok az aminosavcserét okozó mutánsok, összesen 16, amelyek két egymástól független populációban is leírásra kerültek az NCBI adatbázisa alapján. A munkacsoport tíz különböző predikciós program segítségével in silico jósolta ezen variánsok feltételezett általános hatását az NCB5OR fehérjére. Ezeket a predikciókat in vitro sejtes rendszerben feltétlenül szükséges elemezni, a kutatás ezen részébe kapcsolódhattam be. (1. kép)

Az in vitro kísérleteket a mutánsok létrehozásával kezdtem. Az irányított mutagenezis során a vad típusú NCB5OR kódoló régióját tartalmazó plazmidhoz olyan primereket adunk, amelyek tartalmazzák az adott pontmutációt, így a PCR reakció során létrejönnek a mutáns plazmidok. Ezt követően a mutáns plazmidokat kompetens E. coli sejtekbe transzformáltuk. A kultúrákból plazmidot izoláltunk, NanoDrop segítségével koncentrációt mértünk. XhoI és HindIII restrikciós enzimekkel ellenőrző emésztést végeztünk a vad típusú és a mutáns plazmidokon is, illetve agaróz gélen futtattuk, hogy megtudjuk, a mutánsok valóban tartalmazzák-e az inzertet. Azokat a plazmidokat, amelyeknél a plazmid és az inzert is a vad típussal megegyezően futott, szekvenálásra küldtük. A szekvenálással ellenőrizhettük a mutagenezis sikerességét, vagyis hogy kialakult a pontmutáció a megfelelő helyen, majd a sikeresen létrehozott mutánsokat újra transzformáltuk. Ezekből a kultúrákból már nagy mennyiségű és nagy tisztaságú plazmidot izoláltunk.

A folyamatot a sejtes rendszeren való ellenőrzés követte, melyhez humán embrionális vesesejt tenyészetet (HEK293T) használtunk. A HEK293T mintákat tranziensen transzfektáltuk a megfelelően elkészített NCB5OR expressziós konstrukciókkal. Ha a sejtek megfelelően növekedtek, begyűjtöttük az RNS és a fehérje analízisekhez.

Az RNS-szint vizsgálatához minden mintából RNS-t izoláltunk, és a cDNS szintézist követően qPCR-rel mértük az adott mintában található NCB5OR mRNS mennyiségét. Kontrollként a GAPDH-t használtuk, az eredményeket ΔΔCt módszerrel értékeltük ki.

A fehérje analízishez a transzfekciót követően RIPA lízis-pufferben begyűjtött sejteket lecentrifugáltuk, a felülúszót megtartottuk, majd megmértük a koncentrációkat.

A fehérjék további analízisét SDS PAGE segítségével végeztük. A fehérjéket 12%-os poliakrilamid gélen szétválasztottuk, majd nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Az NCB5OR fehérje szinteket specifikus ellenagyag segítségével immunoblottal vizsgáltuk. A membránokat zselatinos pufferrel blokkoltuk, majd hozzáadtuk az elsődleges ellenanyagokat. Kontrollként β-Actin-ra specifikus antitestet alkalmaztuk. A membránokat 4°C-on egy éjszakán át billegtetőn inkubáltuk. Másnap a membránokat PBST-vel mostuk, és másodlagos ellenanyagot adtunk hozzá, hogy a fehérjéket detektálni tudjuk, 1 órán át szobahőn billegtettük, majd PBST-vel mostuk. A HRP-konjugált ellenanyagokat kemilumineszcens szubsztrát hozzáadásával mutattuk ki.

Mivel néhány technikát már ismertem, nagyrészt önállóan tudtam dolgozni, ez sokat segített, hogy átlássak egy teljes munkafolyamatot és megtervezzem a folyamat lépéseit. Természetesen olyan új technikákat is elsajátítottam mint a mutagenezis, transzfekció és immunoblot.

A munkát könnyítette, hogy a munkaközösség rendkívül közvetlen és befogadó volt, így már első naptól kezdve otthonosan tudtam mozogni a laboratóriumban.

A gyakorlat mellett természetesen szórakozásra és kikapcsolódásra is jutott időnk. Ezt inkább a spontaneitás jellemezte, általában különösebb tervezés nélkül vettük nyakunkba a várost így kivétel nélkül tartalmasak és kalandosak voltak a napjaink. Számos budapesti nevezetességhez ellátogattunk, mint a Terror Háza, Szépművészeti Múzeum, Gellért-hegy, de akkor is teljesnek éreztük a napunkat ha éppen csak egy sétához vagy egy belvárosi vacsorázáshoz volt kedvünk. (2. kép)

Úgy gondolom, hogy ez a Budapesten eltöltött 2 hónap nem csak szakmai, hanem önismereti út is volt, hiszen számos, eddig ismeretlen élethelyzettel találkoztam. Sokszor teljesen új perspektívából figyelhettem meg a hétköznapjaimat, ez hozzásegített ahhoz, hogy tudatosabbá, kiegyensúlyozottabbá váljak. Ezért minden hallgatót arra bíztatnék éljen az Erasmus program által nyújtott lehetőségekkel.

Köszönettel tartozom Dr. Kereszturi Évának és a Semmelweis Egyetem Molekuláris Biológia Tanszékének teljes munkaközössége felé, illetve tanáraimnak, akik megalapozták a szakmai gyakorlathoz szükséges tudásomat.